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Q 使用FFPE进行单细胞转录组研究，有什么优势？A
1.样本预处理、保存更加便捷，经过福尔马林固定石蜡包埋后可常温或4℃保存、运输；保存时间更久。
2.可启用医学样本库中大量临床数据完整的FFPE样本，开展回顾性研究，大大缩短课题的样本采集周期。此外，也避免了使用新鲜样本，对后续能否入组数据分析的不确定性。
3.样本可统一解离、逆转录、上机及建库，减少批次效应。
4.适用于一些因解离过度而破碎的组织细胞。
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Q FFPE样本进行脱蜡复水、解离过程，会对细胞的转录组状态有影响吗？A
FFPE转录组状态已经固定，脱蜡复水、解离过程不会影响细胞的转录状态。 -
Q 对FFPE样本是否有限制，质控要求如何？A
建议使用3年及以内的FFPE样本。正式开展单细胞实验前进行DV200质控，以评估对RNA降解程度。
DV200>40%，合格；
DV200≤40%，有风险；
DV200≤30%，风险较高。
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Q 石蜡卷厚度一定要25μm以上吗，临床病理使用的5-10μm厚度是否可以？A
细胞核一般5-10μm，按5-10μm厚度切片，很多细胞核会被切碎，细胞器或胞膜会存在于悬液中。虽然可以通过离心或者试剂盒去碎片的方式来去除，但杂质过多的话，细胞核数量也会有比较大的损失。另外，碎片可能会粘连在细胞核上，造成污染。在第一步分离的时候就尽可能产生少的碎片，因此石蜡卷厚度要求25μm以上。 -
Q 使用随机引物，如何解决核糖体的问题？A
FFPE样本、冻存组织做单细胞核转录组，细胞核内rRNA占比较低，无需额外处理。单细胞转录组需要进行rRNA消减。 -
Q 新鲜细胞也需要进行固定吗？A
是的，有效固定是原位逆转录的前提。 -
Q 新鲜样本与FFPE样本，单细胞转录组结果差别大吗？A
对同一小鼠肾脏新鲜样本及FFPE样本分别检测，两个样本类型的检测结果显著相关，一致性高。
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Q 建议细胞数及测序量是多少？A
建议捕获5000-10000 cells，测序量100-150G。 -
Q LncRNA的比例，mRNA的比例分别是多少？A
不同组织类型略有不同，LncRNA占比10%左右，mRNA占比80-90%。
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